4月9日，奥地利科学技术研究所冯小琦团队在Cell发表了题为Extensive N4 Cytosine Methylation is Essential for Marchantia Sperm Function的研究论文，首次证明了4mC在真核生物中的存在，并详实地阐明，在精子成熟阶段，基因组上发生了广泛的4mC修饰，这对于精子发育与功能至关重要。华南农业大学生命科学学院刘亚林教授作为共同第一作者。

作为表观遗传学的重要修饰，DNA甲基化广泛存在于原核与真核生物中，并发挥关键调控作用。在原核生物中，DNA上胞嘧啶（Cytosine, C）的第四位氮元素可被甲基化修饰形成N4-甲基胞嘧啶（4mC）、第五位碳元素可被甲基化修饰形成C5-甲基胞嘧啶（5mC），腺嘌呤的第六位氮元素可被甲基化修饰形成N6-甲基腺嘌呤（6mA），虽然基因组上甲基化程度不高（大肠杆菌中，约0.5%-0.8%的胞嘧啶，1.5%-2%的腺嘌呤会被甲基化修饰），但DNA甲基化依然发挥着重要的作用，参与调控基因表达和防御反应。然而，在真核生物中，迄今仅发现5mC在基因组上广泛分布，6mA在单细胞生物中有零星分布，而4mC是否存在则仍有很大争议。

在真核生物中，DNA甲基转移酶Dnmt1和Dnmt3介导5mC的甲基化过程，该机制在各物种中高度保守。不同物种的5mC分布有所差异：在脊椎动物中，5mC主要发生在全基因组范围内的CG位点，约80%的CG在人体组织中被甲基化为5mCG；而在开花植物中，5mC则主要发生在转座子区域（Transposon Elements, TE），并存在在CG、CHG和CHH（H代表A、C或T）位点。在动植物的发育过程中，5mC水平在很大程度上保持稳定，一旦紊乱常导致严重发育异常和疾病。然而，在哺乳动物和开花植物的雄性生殖细胞（精子）发育过程中，5mC会经历重编程，这对精子成熟至关重要。

研究发现，4mC在陆地植物地钱 (Marchantia polymorpha) 精子发育过程中由一个新发现的甲基转移酶 (Marchantia polymorpha DNA N4 CYTOSINE METHYLTRANSFERASE1a, MpDN4MT1a) 修饰生成。该研究还发现精子发育经历了两波DNA甲基化重编程：第一波是由MpCMTa和MpDNMT3b调控的5mC重编程，表现为non-CG (CHG和CHH) 位点的全基因组扩张及转座子区域CG位点甲基化的增强；第二波是由MpDN4MT1a调控的4mCG重编程，特异发生于基因区域(genic region)并在精子成熟后期发生（图1）。

图1地钱精子发育过程中甲基化重编程及4mC作为功能性DNA修饰的作用机制

进一步研究发现，全基因组范围内，精子基因组的DNA甲基化水平从营养组织(Thallus)的17%显著上升至成熟精子(Mature sperm)的96%。为了研究这一显著的DNA甲基化变化过程，作者分离了不同发育阶段的精子前体细胞群，结合转录组、甲基化组和发育时期同步分析精子发育过程中的DNA甲基化水平的变化。结果显示，在精子发育过程中，除转座子区外的基因组范围内，有两波(two waves)不同的DNA甲基化修饰的发生，第一波发生在non-CG上，而后第二波发生在CG上。这种全基因组的DNA甲基化修饰与精子的成熟过程高度相关，并且这种现象并不存在于受精后的胚胎 （Embryo，图2）。

图2 精子发育过程中两次广泛的DNA甲基化重编程。A，热图显示了野生型Tak1不同组织中染色体上10 kb窗口的甲基化情况；B，条形图显示了不同组织中具有明显甲基化的100 bp基因组窗口的百分比。

结合转录组和遗传学分析，作者发现了两个5mC甲基转移酶（MpDNMT3b和MpCMTa）在精子发育过程中表达量升高，并进而确认了他们参与调控发生在non-CG的5mC甲基化的重编程（first wave，第一波），但不负责发生在CG上的重编程（second wave，第二波）（图3）。

图3 精子发育过程中non-CG甲基化重编程由5mC甲基转移酶MpDNMT3b和MpCMTa介导诱导。A，MpDNMT3b和MpCMTa在不同组织中的转录水平。TPM表示每百万转录本数量。B，条形图展示了在野生型(WT)、Mpdnmt3b敲低(kd)和Mpcmta敲低(kd)精子中，CG、CHG或CHH甲基化水平大于0.3的100 bp基因组窗口的百分比。

虽然没有任何5mC甲基转移酶的表达和精子的第二波重编程相关，但令人兴奋的是，作者发现了两个全新的甲基转移酶MpDN4MT1s (M. polymorpha DNA 4mC Methyltransferase1a  and 1b, MpDN4MT1a and MpDN4MT1b)。MpDN4MTs不与5mC甲基转移酶同源，但和原核生物的4mC甲基转移酶高度同源。他们在精子发育后期特异表达，暗示他们可能负责第二波发生在CG上的DNA甲基化重编程。作者通过点杂交(Dot blot)，液相质谱(LC-MS)，和遗传学方法，检测并证实了成熟精子中存在4mC修饰，并且是由MpDN4MT1a介导产生的（图4）：

图4 地钱精子中广泛存在4mC，且依赖于MpDN4MT1a。A，MpDN4MT1a和MpDN4MT1b在不同组织中的转录水平；B，系统进化树展示了与两种MpDN4MT1s同源的原核生物5mC和4mC甲基转移酶；C，用4mC抗体进行DNA点杂交免疫检测；D，LC-MS检测甲基化脱氧胞苷标准品和从不同样本中提取的DNA酶解后甲基化脱氧胞苷的峰图。

因为经典的检测DNA甲基化程度的重亚硫酸盐测序 (Bisulfite Sequencing, BS-seq) 不能区别4mC和5mC，所以作者进一步通过单分子实时测序(SMRT-seq)、TET酶辅助的重亚硫酸盐测序技术 (4mC-TAB-seq)、APOBEC介导的脱氨基测序技术(4mC-AMD-seq)和遗传学分析，证实了第二波发生在CG上的甲基化实则是4mC甲基化，由MpDN4MT1a介导，覆盖精子基因组50%以上的CG位点，为真核生物中4mC的存在提供了强有力证据（图5）。

图5 4mC发生于CG位置并富集于基因区域。A，小提琴图展示在WT和Mpdn4mt1-1精子中，通过BS-seq，SMRT-seq和4mC-AMD-seq检测到的100-bp基因组窗口的重复序列(Repeats)和非重复序列(Non-repeats)的甲基化情况；B，展示WT和Mpdn4mt1-1精子中部分基因和转座子序列的CG甲基化的情况。

此外，作者通过CRISPR-Cas9敲除MpDN4MT1a基因，发现突变体精子的染色体可及性增强以及转录组紊乱，并表现出精子游动异常（速度减慢、不定向），育性有缺陷，影响受精后发育。这些结果表明4mC在精子发育和功能中具有关键作用（图6）。

图6 4mC对精子功能和受精后发育至关重要。A，Mpdn4mt1-1突变与WT精子中基因和转座元件(TEs)差异可及性（通过ATAC-seq测量）的概况；B，火山图展示了Mpdn4mt1-1与WT精子相比，上调（绿色）或下调（红色）的转录本。C，Mpdn4mt1-1与WT精子游动路径；D、E，不同材料中精子活动的方向性和速度的统计结果；F，不同材料中异常胚胎的百分比；G，不同材料中胚胎成熟所需的天数。

作者同时还揭示了地钱精子发育中的两波DNA甲基化重编程过程，该过程最终形成了特有的全基因组甲基化修饰模式（覆盖率97%）（图7）。

图7. 地钱精子发育过程中甲基化重编程的时间模式与机制

综上，该研究首次证实了4mC在真核生物中的存在，揭示了在地钱精子成熟过程中基因组范围内编码区的大规模4mC修饰，保障了精子的正常发育和正常功能，对精子命运的重要决定性，发现并鉴定了负责4mC修饰的真核4mC甲基转移酶。此研究拓展了真核生物中表观遗传学的认知，发现了参与生殖发育过程至关重要的表观遗传学新修饰，开创了4mC在真核生物中功能的研究新方向，拓展了表观遗传学领域的边界。

该论文的通讯作者为现任奥地利科学技术研究所（ISTA），前任英国John Innes Centre (JIC) 的冯小琦教授。James Walker (JIC, 现任职于The Salk Institute)、张静懿（JIC，现任职于华南农业大学农学院）、刘亚林（JIC，现任职于华南农业大学生命科学学院）和许淑娟（ISTA）为本文共同第一作者。于义溟 (ISTA) 、Martin Vickers (JIC) 、欧阳维枝(ISTA) 、Judit Tálas (JIC) 、Liam Dolan (Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology)、Keiji Nakajima (Nara Institute of Science and Technology) 参与了研究。

（图文转载至微信公众号：BioArt植物）